مطالعه پایداری ساختمانی آنزیم پپسین درحضور اوره

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوشیمی، دانشگاه پیام نور

2 دانشیار، دانشگاه شهرکرد

3 کارشناس ارشد فیزیک پزشکی،دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

چکیده

   آنزیم پپسین(E.C.3.4.23.1) نوعی آسپارتیک پروتئیناز شیره معده است که در شرایط بسیار اسیدی عمل می­کند. این آنزیم به طبقه هیدرولازها تعلق دارد و ساختمان منومر شامل دو لوب کروی بوده که از نظر اندازه و فولدینگ زنجیر پلی پپتیدی بسیار نزدیک هستند. این آنزیم واجد یک رشته پلی پپتیدی با وزن مولکولی 34644 دالتون و327 اسیدآمینه است. آنالیز ساختاری آن نشان می دهد که2/1 درصد اسیدآمینه های آن بازی، 1/13درصد اسیدی، 5/46 درصد اسیدآمینه های قطبی و2/39درصد اسیدآمینه های هیدروفوبیک هستند.پایداری ساختاری این آنزیم با استفاده از تکنیکهای اسپکتروفتومتری در ناحیه ماوراء بنفش واسپکتروفلوریمتری درحضور تاثیر دگرگون کننده اوره بررسی شد. مطالعه فوق بااستفاده از بافر02/0 مولار سدیم فسفات با 2=pH  و در دامنه دمایی 30 تا100درجه سانتیگراد انجام شد. نتایج به دست آمده نشان داد که: 1)پایداری قابل توجه آنزیم پپسین(Tmبالا نسبت به سایرهیدرولازها) 2) کاهش پایداری حرارتی آنزیم پپسین(Tm آنزیم) درحضور اوره و 2=pH 3)کاهش مقادیر پارامترهای ترمودینامیکی و درحضوراوره 4)افزایش شدت فلوئورسانس وماکزیمم طول موج نشر آنزیم پپسین در حضور اوره. 

کلیدواژه‌ها


مجله علمی پژوهشی زیست شناسی جانوری تجربی

سال اول، شماره اول، تابستان 1391(34 - 27)

 

مطالعه پایداری ساختمانی آنزیم پپسین درحضور اوره

محبوبه کوهیان1*، بهزاد شارقی2،فریده کوهیان3

1. کارشناس ارشد بیوشیمی، دانشگاهپیام نور 2. دانشیار، دانشگاه شهرکرد      3. کارشناس ارشد فیزیک پزشکی،دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

 

(تاریخ دریافت: 23/12/1390 ، تاریخ تصویب: 21/4/1391)

 

چکیده

   آنزیم پپسین(E.C.3.4.23.1) نوعی آسپارتیک پروتئیناز شیره معده است که در شرایط بسیار اسیدی عمل می­کند. این آنزیم به طبقه هیدرولازها تعلق دارد و ساختمان منومر شامل دو لوب کروی بوده که از نظر اندازه و فولدینگ زنجیر پلی پپتیدی بسیار نزدیک هستند. این آنزیم واجد یک رشته پلی پپتیدی با وزن مولکولی 34644 دالتون و327 اسیدآمینه است. آنالیز ساختاری آن نشان می دهد که2/1 درصد اسیدآمینه های آن بازی، 1/13درصد اسیدی، 5/46 درصد اسیدآمینه های قطبی و2/39درصد اسیدآمینه های هیدروفوبیک هستند.پایداری ساختاری این آنزیم با استفاده از تکنیکهای اسپکتروفتومتری در ناحیه ماوراء بنفش واسپکتروفلوریمتری درحضور تاثیر دگرگون کننده اوره بررسی شد. مطالعه فوق بااستفاده از بافر02/0 مولار سدیم فسفات با 2=pH  و در دامنه دمایی 30 تا100درجه سانتیگراد انجام شد. نتایج به دست آمده نشان داد که: 1)پایداری قابل توجه آنزیم پپسین(Tmبالا نسبت به سایرهیدرولازها) 2) کاهش پایداری حرارتی آنزیم پپسین(Tm آنزیم) درحضور اوره و 2=pH 3)کاهش مقادیر پارامترهای ترمودینامیکی و درحضوراوره 4)افزایش شدت فلوئورسانس وماکزیمم طول موج نشر آنزیم پپسین در حضور اوره

واژه های کلیدی: پپسین، اوره، پایداری ساختاری، دگرگون شدن

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


* نویسنده مسئول: محبوبه کوهیان                                                                                                                                   Email: m_kouhiyan@yahoo.com

 


 

 

 

مقدمه

   پپسین(E.C.3.4.23.1) نوعی آسپارتیک پروتئیناز شیره معده است (Fluhrer & Haass, 2009) که واجد یک رشته پلی پپتیدی با 327 باقیمانده آمینواسیدی می باشد(Cho& Northrop,1998). وزن مولکولی آن 34644 دالتون است .پپسین در طبقه سوم یعنی هیدرولازها قرار دارد (Haldar&Chattopadhyay,2010). ساختار این آنزیم منومر  شامل دو لوب کروی بوده که از نظراندازه وفولدینگ زنجیرپلی پپتیدی بسیار نزدیک هستند. در میان این دو لوب شکاف  بزرگی وجود دارد که جایگاه اتصال سوبسترا و جایگاه فعال آنزیم در آن قرار دارند(Marciniszyn, & Huang, 1998) . با تغییر محیط فیزیکی یا شیمیائی یک پروتئین امکان دگرگون شدن آن وجود دارد که معمولاً روشهای دگرگون کردن عبارتند از: حرارت دادن، افزودن یک دگرگون کننده شیمیایی ما نندDTAB، تغییر pH به حالت اسیدی یا قلیایی و عمل کردن در فشار بالا. هدف اصلی ازمطالعات دگرگون سازی پروتئینها به دست آوردن اطلاعات اضافی درمورد ساختمان، خواص و عملکرد پروتئینها می باشد. مطالعات در زمینه غیرطبیعی کردن پروتئینها در محلولهای آبی انجام می شود و بنابراین در درک عملکرد پروتئینها تحت شرایط فیزیولوژیک مفید واقع می شود. فرایند دگرگون سازی پروتئینها برای مطالعه نیروهای تعیین کننده ساختمان سوم حائز اهمیت است(Ano Bom,Monica, Freitas, & Silva,2010). استفاده دیگر ازمطالعات دگرگون سازی،  مطالعه نیروهای موثر ونقش انواع پروتئینها میان کنش ها در جایگاه فعال آنزیم می باشد. با توجه به توضیحات کلی ارائه شده درمورد فولدینگ پروتئینها و دناتوره شدن آنها باید گفت که جزئیات کمی درمورد ساختارهای حالت دگرگون شده آنزیم های پروتئاز به ویژه پپسین وجود دارد (Schellman,2002) که در مطالعه حاضر تاثیر دگرگون کننده اوره بر ساختار آنزیم پپسین بررسی می شود.

مواد وروش ها

   آنزیم پپسین با منشا پورسین و همچنین اوره از شرکت  مرک خریداری شد. اندازه گیری طیفی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر فارما سیا مدل4000 مجهز به سیستم کنترل الکترونیکی دما در دامنه حرارتی 30 تا 100 درجه سانتیگراد انجام شد.اندازه گیریهای فلوریمتری به کمک دستگاه اسپکتروفلوریمتر فارما سیا مدل RF-5301 مجهز به حمام آب گرم صورت گرفت.

روش ها

1- بررسی پایداری حرارتی آنزیم پپسین در حضوراوره در 2=pH و دامنه حرارتی 100 – 30:  بافرفسفات سدیم با 2=pH در غلظت M 02/0 و محلول اوره با غلظت 8 مولار و در 2=pH تهیه شد. منحنی های دگرگون سازی در حضوراوره در طول موج 280  نانومتر با استفاده از محلولهای پپسین با غلظت 3 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آمده است.

2-بررسی اسپکتروفلوریمتری آنزیم پپسین در حضور اوره در 2=pH و دماهای گوناگون:  بافر فسفات سدیم با  2=pH در غلظت M 02/0 و محلول اوره هم با غلظت 8 مولار در 2=pH تهیه شد. غلظت نمونه آنزیم پپسین 3  میلی گرم بر میلی لیتر است. بررسیهای فلوریمتری در pH مورد بررسی در هشت غلظت مختلف (صفر تا هفت مولار) و در دماهای گوناگون انجام شد.

نتایج و بحث

   شکل 1 نشان دهنده تغییرات کسر پروتئین دگرگون شده درمقابل دما برای غلظتهای مختلف اوره در 2=pH است. همانطور که مشاهده می شود در غیاب اوره، مقدار Fd تا دمای K 338 صفر است. کسر پروتئین دگرگون شده با پذیرفتن مکانیسم دو حالته و با استفاده از رابطه1 محاسبه شده است.

(1)

 در این رابطه و  به ترتیب مقادیر جذب نوری مولکولهای طبیعی و دگرگون شده در حالتی میباشد کهY مورد اندازه گیری واقع شده است(13). در مورد 2=pH با افزایش غلظت اوره،  منحنی های دگرگون سازی به سمت چپ جابه جا می شوند. به عبارت دیگر حضور اوره سبب کاهش پایداری آنزیم پپسین در  2=pH می شود. برای محاسبه تغییردر انرژی آزاد حالتهای طبیعی و دگرگون شده ، ، میتوان از رابطه 2 استفاده کرد (Pace, Shirley ,1989)

.

(2)  ΔD= -RTln [Fd / (1-Fd)] = -RTln [(YN-Yobs) / (YN-YD)]

 

در این رابطه، R  ثابت گازها و ‏T  دما بر حسب کلوین است. دمای ذوب پروتئین(Tm)، دمایی است که مقدار  درآن دما برابر صفر است. منحنی تغییرات بر حسب دما در شکل 3، ارائه شده است. با افزایش غلظت اوره، منحنی های فوق به سمت چپ انتقال می یابند و بنابر این Tm آنزیم کاهش می یابد. مقدار Tm برای آنزیم پپسین K 340 است. تاثیر اوره بر مقدار Tm درجدول 1 ارائه شده است. چنانچه ملاحظه می شود حضور اوره سبب کاهش Tm آنزیم می شود. با افزایش غلظت اوره از یک تا هفت مولار، Tmآنزیم کاهش می یابد به طوریکه در غلظت هفت مولار به K330 میرسد. شیب منحنی بر حسب دما در نقطه Tm برابر  است.   

  

 

 

شکل1- منحنی تغییرات کسر پروتئین دگرگون شده در مقابل حرارت در غلظتهای مختلف اوره و بافر02/ 0مولار سدیم فسفات و 2=pH

 

 

 

شکل2- تغییرات شدت فلوئورسانس آنزیم پپسین در حضور اوره در بافر 02/0مولار سدیم فسفات و 2=pH

 

 

شکل3- منحنی تغییرات  در مقابل دما در حضورغلظتهای مختلف  اوره و بافر02/0مولارسدیم فسفات و 2=pH

 

برای محاسبه ، با در نظر گرفتن مقدار صفر برای  می توان از رابطه 3 استفاده کرد.

(3)      =

 و به ترتیب تغییر انتروپی و آنتالپی در دمای  Tm می باشند. جدول 1 نشان دهنده مقادیر پارامترهای فوق    می باشد. مقادیر  و  با افزایش غلظت اوره کاهش می یابد. کاهش مقادیر این دو پارامتر به منزله بازتر شدن شکل طبیعی آنزیم و افزایش کسر پروتئین دگرگون شده میباشد. توابع ترمودینامیکی و را می توان به صورت زیر بیان کرد: , Shirley ,1989) ( Pace 

 

(4)     

(5)   

 

در این روابط، D نمایانگر حالت دگرگون شده و N نمایانگر حالت طبیعی پروتئین است. با توجه به اینکه حالت دگرگون شده به صورت پیچه منظم در نظر گرفته می شود، کاهش مقادیر و  مبین باز شدن شکل طبیعی آنزیم می باشد. با توجه به شکل 2 که تغییرات شدت فلوئورسانس آنزیم پپسین را درحضور غلظتهای مختلف اوره و دردامنه دمایی30 تا C º60 در 2=pH نشان می دهد، مشخص است که با افزایش غلظت اوره شدت فلوئورسانس افزایش می یابد، به این مفهوم که آنزیم بازتر شده است پس پایداری پپسین درحضور اوره و 2=pH کاهش یافته است. در شکل 4، تغییرات ماکزیمم طول موج نشر آنزیم پپسین در حضور غلظتهای مختلف اوره در 2=pH و دامنه دمایی 30 تاCº60 آمده است، همانطورکه مشاهده می شود با افزایش غلظت اوره، ماکزیمم طول موج نشر آنزیم افزایش می یابد. نتایج فوق در تطابق کامل با نتایج حاصل از مطالعات اسپکتروفتومتری بوده و مویدکاهش پایداری آنزیم پپسین در حضور اوره می باشد.

 

جدول1- پارامترهای ترمودینامیکی بر هم کنش آنزیم پپسین و اوره

 

M

[urea]

 

 

 

K

 

0

8000

340

2720

1

4666

338

108/1577

2

4600

337

002/1550

3

4000

336

1340

4

4000

336

1344

5

3200

334

008/1068

6

7/2666

333

100/888

7

2000

330

660

 

در خصوص دگرگون سازی اوره بر پروتئین ها، دو مکانیسم، توجیه گر توانایی اوره در ناپایدار سازی حالت طبیعی پروتئین های کروی می باشد. در مکانیزم اول اوره با گروههای عاملی زنجیره پلی پپتیدی بر هم کنش داده و ایجاد اتصالات هیدروژنی می نماید (Kraulis,1991). در مکانیسم دوم اوره سبب حلالیت زنجیره های جانبی غیر قطبی مدفون شده در بخشهای داخلی پروتئین با اعمال افزایش اثرات هیدروفوبیک می شود (Smith,2005). اوره سبب کاهش ثابت دی الکتریک حلال شده و به این ترتیب با کاهش میزان قطبیت حلال،  تمایل زنجیره های جانبی غیر قطبی مدفون شده،  به اینکه در معرض واکنش قرار گیرند، افزایش می یابد و به این ترتیب ساختار پروتئین دچار دگرگونی می شود    (Tobi,Elber&Thirumalia,2003). مطالعات انجام گرفته در مورد بر هم کنش اوره با ترکیبات مدل مانند دی کتو پیپر آزین نمایانگر وجود بر هم کنشهای هیدروژنی بین اوره و گروههای پپتیدی ترکیبات مدل وپروتئینها در محیطهای آبی می باشد .(Mcphie, 1998) نتایج حاصل از مطالعات گوناگون بر آنزیم لیزوزیم نمایانگر دگرگون سازی آنزیم فوق در حضور اوره به واسطه هر دو مکانیسم یاد شده می باشد (Antos, Spooner& Ploegh,2009) مطالعه انجام شده در مورد آنزیم پپسین درحضور اوره نشان دهنده کاهش Tm آنزیم است، به این مفهوم که اوره ساختار آنزیم پپسین را ناپایدار کرده است. در  2=pH، Tm آنزیم طبیعی که ˚C 67 است با افزایش غلظت اوره کاهش    می یابد. در غلظت یک مولار اوره  به ˚C 65، در غلظت دو  مولار به C º 64، در غلظت سه مولار به ˚C 63،  در غلظت چهارمولار به ˚C63 ، در غلظت پنج مولار به˚C 61 و در غلظت شش و هفت  مولار به ترتیب به 60 و 57 درجه سانتیگراد می رسد. مقادیر   و  برای آنزیم پپسین در غیاب اوره به ترتیب برابر2720 و 8000  می­ باشد. با افزایش غلظت اوره، مقادیرفوق کاهش یافته و نهایتاً در غلظت 7 مولار اوره این مقادیر به ترتیب  660  و 2000 خواهد بود. کاهش مقادیر پارامترهای ترمودینامیکی فوق به منزله باز شدن شکل طبیعی آنزیم و کاهش پایداری آن  می باشد (Skashi,2006) . با افزایش باز شدگی ساختار آنزیم گروههای آروماتیک نظیر Phe، Trp و Tyr بیشتر در معرض واکنش قرار گرفته و در نتیجه شدت فلوئورسانس افزایش می‌یابد (Nubinstein& Sherman,1997)

 

 

شکل4- تغییرات ماکزیمم طول موج نشر آنزیم پپسین در حضور اوره در بافر 02/0 مولار سدیم فسفات و 2=pH

 

و با توجه به کاهش اختلاف سطح انرژی بین حالتهای پایه و برانگیخته در حضور اوره شاهد افزایش طول موج نشر خواهیم بود. (Huang &Steven,1998) در مجموع می توان عنوان نمود که اوره از یک طرف سبب کاهش پلاریته حلال و ثابت دی الکتریک آن می شود و از طرف دیگر هم به اتصالات پپتیدی در سطح پپسین متصل می شود (Haq, Gianni & Jemth,2010) و ساختار آنزیم را باز می کند که در نهایت موجب کاهش پایداری آنزیم می­ ­شود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

سپاسگزاری

   محققین مراتب تشکر و قدردانی خود را از تمامی افرادی که در این مطالعه همکاری داشتند اعلام می دارند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

Structural study on pepsin stability in the presence of urea

M. Kouhiyan1*, B.Shareghi2, F. Kouhiyan3

1. MSc of Biochemistry, payam Noor University

2. Associated Professor., shahrekord University

3. MSc of Medical Physic,Isfahan University of Medical Sciences

 

(Received: Mar. 13, 2012; Accepted: Jul. 11, 2012)

 

ABSTRACT

 

Pepsin (E.C.3.4.23.1) is a juice gastric aspartic proteinase. It belongs to hydrolyses family. Its monomeris structure is consisting of two lobes that they are similar in size and folding. It consists of a single polypeptide chain of molecular weight 34644 Daltone and 327 aminoacid. Structural analysis shows that pepsin contains 1.2% basic residues, 13.1% acidic residues, 46.5% polar residues and 39.2% hydrophobic residues. Structural stability of pepsin was investigated by UV-VIS spectrophotometer and spectrophlorimetry. Spectral measurements were made by sodium phosphate buffer .02M at pH: 2 and temperatures between 30 and 100 º   C. It was observed that (1) high considerable enzyme stability, (2) enzyme stability decreases in the presence of urea at pH: 2. (3) thermodynamic parameters decline in the presence of urea. (4) Florescence intensity increase in the presence of urea.

Keywords: Denaturation, Pepsin, Urea, Structural stability

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


* Corresponding author: Mahbobeh Kouhiyan,                                                                            Email: m_kouhiyan@yahoo.com

 

REFERENCES:

Ana, Paula D. Ano Bom, Monica S. Freitas, and Jerson L. Silva.( 2010 )The p53 Core Domain Is

      A Molten Globule at Low pH: J. Biol. Chem285: 2857-2866.

Antos,John M. Eric Spooner, and Hidde L. Ploegh,A(2009) Straight Path to Circular Proteins J.

      Biol. Chem. 284: 16028-16036.

Cho, Y. K. and Northrop, D.B (1998) Transpeptidation by porcine pepsin catalysed by a

      noncovalent intermediate unigue to isomechanism .J. Bio. Chem. 273. 24305- 24308.

Fluhrer Regina and Haass Christian (2009) Intramembrane Proteolysis by Signal Peptide

      Peptidases: A Comparative Discussion of GXGD-type Aspartyl Proteases. J. Biol. Chem.

      284: 13975-13979.

Haldar ,Shubhasis  and Krishnananda Chattopadhyay(2010). Role of Protein Stabilizers on the

      Conformation of the olded State of Cytochrome c and Its Early Folding Kinetics:

      Investigation at single molecular resolution J. Biol. Chem. 285: 25314-25323.

Haq ,S. Raza, Stefano Gianni and Per Jemth,(2010)  The Plastic Energy Landscape of Protein

      Folding: a triangular folding mechanism with an equilibrium intermediate for a small protein

      J. Biol. Chem. 285: 18051-18059.

Huang Xin, and Steven T. Olson,(2008) Kinetic Characterization of the Protein Z-dependent

      Protease Inhibitor Reaction with Blood Coagulation Factor Xa J. Biol. Chem. 283: 29770-

      29783.

Kraulis, P. J. MOLSCRIPT: (1991) A program to produce both detailed and schematic plots of

      Protein structure. J. Appl. Crystallogr. 24. 946- 950.

Marciniszyn, J.,and Huang, W.T.(1998) Primary structure of porcine pepsin .Journal of Biol

      .Chem .250, 13. 5076- 5081.

Mcphie, P. A. (1998) spectrophotometric investigation of pepsinogen-pepsin conversion .J. Biol.

      Chem. 247. 4272- 4281.

Nubinstein, A., Sherman, S. (2004) Influence of the solvent structure on the electrostatic

      Interactions in proteins. Biophysical Journal. 873. 1544-1557.

Pace, C.N. Shirley, B. A. (1989) Protein Structure: A practical Approch (Creighton, T. E. ed.)

      311,120-126.  

Schellman, J. A. (2006). Fifty years of solvent denaturation.Biophys.Chem,96, 91-101

Skashi,M.(2006).Probing the Structure of the Infectious Amyloid Form of the Prion-forming

      Domain of HET-s Using High Resolution Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by

      Mass Spectrometry J. Biol. Chem. 280: 13220-13228.

Smith, f. (2005) Specific Inhibition and Stabilization of Aspergilloglutamic Peptidase by the

      Propeptide:indentification of critical sequences and residues in the propepeptid J. Biol.

      Chem. 280: 999-1006.

Tobi,D.,R.Elber and D. Thirumalia, (2003).Water and protein: A love-hate relationship.

      Biopolymers, 68, 359-369.