با همکاری مشترک دانشگاه پیام نور و انجمن فیزیولوژی و فارماکولوژی ایران

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دکتری رشته بیوشیمی، گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، ‏تهران، ایران

2 استادیار، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات ‏واکسن و سرم‌سازی رازی، مشهد

3 استادیار بیوشیمی، گروه زیست‌شناسی، دانشگاه ‏پیام نور، تهران، ایران

چکیده

لومازین سنتاز بروسلایی، آنزیم دخیل در بیوسنتز ریبوفلاوین، مرکب از 10 زیرواحد مشابه می‌باشد که به‌صورت کپسیدی تجمع می یابند. با توجه به کاربردهای وسیع لومازین سنتازها در زمینه‌های بیولوژی، تولید لومازین سنتاز در مقیاس بالا و خالص‌سازی کارآمد آن ضروری می‌نماید. در مطالعه حاضر، ساختار اولیه لومازین سنتاز بروسلا ملی‌تنسیس از پایگاه داده NCBI دریافت گردید. توالی لومازین سنتاز ابتدا با استفاده از واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز تکثیر گردید و سپس کلون و بیان گردید. بیان سازه با استفاده از پلازمید بیانی pET28a و در باکتری BL21 DE3 انجام گردید. برای حذف بقایای دیواره باکتری و خالص‌سازی پروتئین، از روش‌های رسوب‌دهی با آمونیوم سولفات و تکنیک‌های کروماتوگرافی تعویض یونی استفاده گردید. از آزمون‌های الیزا و وسترن بلات جهت تأیید بیان و مانیتورینگ مراحل استفاده گردید. خالص‌سازی لومازین سنتاز با استفاده از روش کروماتوگرافی با استفاده از سفادکس دی اتیل آمینو اتیل DEAE منجر به حصول باند یگانه در الکتروفورز با ژل پلی اکریلامید (SDS-PAGE) گردید. نتایج این بررسی نشان داد که روش‌های بهینه‌سازی بیان و خالص‌سازی مورد استفاده در این تحقیق، می‌تواند در تولید لومازین سنتاز نوترکیب بروسلایی خالص و در مقیاس بالا به‌عنوان یک محصول نوترکیب ارزشمند در تحقیقات واکسن استفاده گردد.

کلیدواژه‌ها

Alvarez, P.; Zylberman, V.; Ghersi, G.; Boado, L.; Palacios, C.; Goldbaum, F.; Mattion, N.; ‎‎(2013). Tandem repeats of the extracellular domain of Matrix 2 influenza protein exposed in ‎Brucella lumazine synthase decameric carrier molecule induce protection in mice. Vaccine; ‎‎31(5): 806-812.‎
Baldi, P.; Velikovsky, C.; Braden, B.; Giambartolomei, G.; Fossati, C.; Goldbaum, F. (2000). Structural, functional and immunological studies on a polymeric bacterial protein. Brazilian ‎Journal of Medical and Biological Research; 33(7): 741-747.‎
Liu, W., Sohn, H.W.; Tolar, P.; Pierce, S.K. (2010). It’s all about change: the antigen-driven ‎initiation of B-cell receptor signaling. Cold Spring Harbor perspectives in biology; 2(7): ‎a002295.‎
Mejias, M.P.; Ghersi, G.; Craig, P.O.; Panek, C.A.; Bentancor, L.V.; Baschkier, A.; ‎Goldbaum, F.A.; Zylberman, V.; Palermo, M.S. (2013). Immunization with a chimera consisting ‎of the B subunit of Shiga toxin type 2 and brucella lumazine synthase confers total ‎protection against Shiga toxins in mice. Journal of Immunology; 191(5): 2403-2411.‎
Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, ‎Cold spring harbor laboratory press.‎
Sambrook, J.; Russell, D.W. (2006). Purification of nucleic acids by extraction with ‎phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols; 2006(1): pdb. prot4455.‎
Sciutto, E.; Toledo, A.; Cruz, C.; Rosas, G.; Meneses, G.; Laplagne, D.; Ainciart, N.; Cervantes, J.; ‎Fragoso, G.; Goldbaum, F.A. (2005). Brucella spp. lumazine synthase: a novel antigen ‎delivery system. Vaccine 23(21): 2784-2790.‎
Velikovsky, C.A.; Cassataro, J.; Giambartolomei, G.H.; Goldbaum, F.A.; Estein, S.; Bowden, R.A.; Bruno, ‎L.; Fossati, C.A.; Spitz, M. (2002). A DNA vaccine encoding lumazine synthase from ‎Brucella abortus induces protective immunity in BALB/c mice. Infect Immun; 70(5): 2507-‎‎2511.‎
Wei, Y.; Kumar, P.; Wahome, N.; Mantis, N.J.; Middaugh, C.R. (2018). Biomedical ‎Applications of Lumazine Synthase. J Pharm Sci.; 107(9): 2283-2296.‎
Zhang, X. (2005). Structural studies of lumazine synthases: Thermostability, catalytic ‎mechanism and molecular assembly, Biovetenskaper och näringslära/Biosciences and ‎Nutrition.‎
Zhang, X.; Konarev, P.V.; Petoukhov, M.V.; Svergun, D.I.; Xing, L.; Cheng, R.H.; Haase, I.; ‎Fischer, M.; Bacher, A.; Ladenstein, R.; Meining, W. (2006). Multiple assembly states of ‎lumazine synthase: a model relating catalytic function and molecular assembly. J Mol Biol.; ‎‎362(4): 753-770.‎
Zylberman, V.; Craig, P.O.; Klinke, S.; Braden, B.C.; Cauerhff, A.; Goldbaum, F.A. (2004). High order quaternary arrangement confers increased structural stability to Brucella sp. ‎lumazine synthase. J Biol Chem.; 279(9): 8093-8101.‎
Zylberman, V., Klinke, S.; Haase, I.; Bacher, A.; Fischer, M.; Goldbaum, F.A. (2006). Evolution ‎of vitamin B2 biosynthesis: 6, 7-dimethyl-8-ribityllumazine synthases of Brucella. Journal of ‎bacteriology; 188(17): 6135-6142.‎