B Cell Line (Raji) and T Cell Line (molt-4) Tolerance to Low Concentration Zinc Chloride in Vitro Study

Nasri, S.; Bidaran, Sayeh.; Nasiri, P.

Document Type : Article

Authors

¹ Assistant Professor, Department of Bioloty, Payam-e-Noor Uiversity, Tehran,

² Animal Physiology, Department of Biology, Payam-e-Noor Uiversity, Tehran

³ Associate Professor, Academic Department of Statistics and Mathematics, Payam-e-Noor Uiversity, Tehran

Abstract

Introduction & Objective: Zinc is an essential element for the immune system. This element has different effects on immune system activity. On the other hand, different serum Zn levels also alter normal B-cell line and T-cell line functions. The present study was carried out to assess B cell line and T cell line tolerance to low concentration Zinc Chloride In vitro study. This experimental study was conducted at the Payame Noor University of Tehran in 2010. The B- cell line and T-cell line were exposed to 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100,125, 150,175 and 200 µm (λ) of Zinc Chloride followed by incubation at 12, 24, 36, 48, 60 and 72 hrs. Viability of B- cell line (Raji) and T-cell line (molt-4) were evaluated with hemocytometer method and percentage of living cells have been considered as cellular tolerance index to cytotoxic effects of Zinc chloride. The results were analyzed by SPSS software, version 18 using T-test and Kruskal-Wallis test. In this study, the results showed Zinc chloride concentrations up to 40 µm (λ) at different incubation time points (12-72 hrs) had no effects on B cell line and T cell line viability ( p> 0.05) With 50-200 µm (λ) concentrations, Zinc at different incubation time points (12-72 hrs) tolerance B cell and T cell line decreased and viability decreased significantly when compared with the control group and test groups up to 40 µm (λ) concentration ( p< 0.05). All groups at different after incubation time , Zinc concentrations (50-200 µm ) B cell and T cell line tolerance decreased significantly when compared with Zinc chloride concentrations up to 40 µm (λ) ( p< 0.05). Zinc is necessary for the normal function of the immune system. A variety of in vitro effects of zinc on B cell line and T cell line depend on the zinc concentration. High dosages of zinc evoke negative effects on B cell line and T cell line. An excess of zinc can inhibit B- cell line and T-cell line function.

Keywords

20.1001.1.23222387.1391.1.2.5.4

Full Text

مقدمه

بیش از دو قرن پیش مشخص شد که عنصر روی (Zn) برای رشد آسپرژیلوس نیگرا لازم است (Raulin, 1869). ضرورت وجود عنصر روی برای رشد و تکوین جنین راتها به اثبات رسیده است و سپس سندرم فقدان روی به همراه آثاری چون آنمی، عدم رشد اندام تناسلی و غدد تناسلی در کودکان مشاهده شد (Vallee, 1993). عنصر روی به عنوان کوفاکتور برای بیشتر از 300 نوع آنزیم، به خصوص متالوآنزیم‏ها و عوامل موثر در نسخه‏برداری (RNA پلیمراز و DNA پلیمراز) شناخته شده است (Overbeck, 2008). کاهش عنصر روی منجر به تضعیف عملکرد سیستم ایمنی می‏گردد، ضرورت هموستازی روی در بدن که بوسیله پروتئین انتقالی و ناقل روی صورت می‏گیرد برای عملکرد صحیح سیستم ایمنی به اثبات رسیده است (Rink, 2007). کاهش مقادیر روی در بدن به همراه آتروفی تیموس، کاهش ایمنی و افزایش عفونت‏های ویروسی، قارچی و باکتریایی به اثبات رسیده است (Mills, 1989). مقدار کلی عنصر روی در بدن انسان حدود 4-2 گرم است و غلظت عنصر روی در پلاسما حدود µm16-12 است. مقدار زیادی از این عنصر در سرم خون توسط آلبومین و به مقدار کمتر توسط ترانسفرین حمل می‏شود. در ضمن هیچ سیستم ذخیره ای مخصوص عنصر روی در بدن انسان تاکنون گزارش نشده است (Chavakis, 1999). روی عامل آنتی‏اکسیدانی است و نقش مهم و محافظت‏کننده‏ای در برابر رادیکال‏های آزاد دارد (Roussel, 2003; Saki, 2009). در روند بلوغ و تکامل دستگاه‏های تولیدمثلی، در روند درمان سرطان پروستات، بزرگی خوش‏خیم و تورم پروستات نقش مکمل روی ثابت شده است. همچنین در دوران بارداری و شیردهی در زنان مصرف روی افزایش می‏یابد (Vallee, 1993). کاهش عنصر روی می‏تواند بر روی فعالیت کموتاکسی نوتروفیل‏ها، در فعال‏سازی سلول‏های کشنده و فاگوسیتوز ماکروفاژها اثر بازدارنده داشته باشد (Keen, 1990). روی می‏تواند با اثر بر بیان رسپتورهای اینترلوکین 2 بر تکثیر سلول‏های لنفوسیتی اثر بگذارد (Saha, 1995). از طرف دیگر تأثیر عنصر روی بر تکوین و تمایز و تکثیر لنفوسیت‏های T ثابت شده است و کاهش آن نیز اثر مهاری بر میزان ترشح تیمولین (هورمون تیموسی) دارد که تمایز لنفوسیت‏های T را به تعویق می‏اندازد
(Crea, 1990) در واقع عنصر روی در مقادیر متفاوت هم در محیط بدن انسان (In vivo) و هم در محیط آزمایشگاهی (In vitro) می‏تواند اثرات متناقضی بر فعالیت لنفوسیت‏های B و T داشته باشد. بعضی از بیماری‏های خودایمن با منشأ آسیب‏شناسی سلول‏های T متعاقب کاهش روی صورت می‏گیرد (Campo, 2000). در مطالعه‏ای که توسط (Michiko et al., 2000) در خصوص اثر کلرید روی بر سلول‏های زنده مولت-4 انجام گردید مشخص گردید در غلظت‏های بالاتر ار 100 میکرومولار کاهش معنی‏داری در تعداد سلول‏های زنده مولت-4 دیده می‏شود (Michiko, 2000). مطالعه‏های Siegel et al. (2006) در محیط آزمایشگاهی نشان می‏دهد عدم تعادل روی در بدن سبب مرگ برنامه‏ریزی شده و آپوپتوزیس می‏گردد (Siegel, 2006). در مطالعاتی که بر اثر غلظت‏های مختلف روی در محیط آزمایشگاهی انجام شده است بیشتر اثرات سمیت سلولی عنصر روی در مقادیر بالا بر روی رده سلولی لنفوئیدی مورد بررسی قرار گرفته است و کمتر به اثر مقادیر پائین عنصر روی بر سلول‏های ایمنی به خصوص لنفوسیت‏ها پرداخته شده است و همچنین مطالعات قبلی اکثراً بر روی رده سلول‏های T بوده و یک گزارش در ایران بر روی اثر روی بر مخلوطی از سلول‏های رده لنفوئیدی بدون در نظر گرفتن پاسخ هر یک به طور مجزا انجام شده است (تکمهداشی، 1384) و تاکنون گزارشی مبنی بر بررسی اثر عنصر روی برسلول رده لنفوئیدی T و B (راجی و مولت-4) به طورمجزا و جداگانه در دست نیست. از آنجا که تحمل و پاسخ سلولی رده لنفوئیدی B و Tنسبت به عنصر روی می‏تواند متفاوت باشد در این مطالعه میزان تحمل مقادیر کم کلرید روی در دو نوع سلول‏های رده لنفوئیدی B و T (راجی و مولت-4) به طور جداگانه و در محیط کشت مورد ارزیابی قرار گرفت.

مواد و روش‏ها

این تحقیق یک مطالعه تجربی است که در سال 1389 و 90 در دانشگاه پیام‏نور انجام شد. برای تهیه محلول یکنواخت، کلرید روی (تهیه شده از شرکت مرک آلمان) را با فیلتراسیون غشایی فیلتر کرده، از کلرید روی یک مولار غلظت‏های 1، 5، 10، 20، 30، 40، 50، 75، 100، 125، 150، 175 و 200 میکرومولار تهیه می‏گردد. در زیر هود بیولوژیک از سلول‏های رده لنفوئیدی B و T سوسپانسیون سلولی به روش زیر تهیه شد: به 40 میکرولیتر از هر گروه سلول رده لنفوئیدی B وT (سلول‏های راجی و مولت-4 تهیه شده از انستیتو پاستور) 40 میکرولیتر معرف تریپان بلو (W/V %2/0 تریپان بلو در بافر PBS) اضافه نموده (Butler, 2004)، و به مدت 2 دقیقه در دمای اتاق قرار داده و سپس بوسیله پیپت پاستور مقداری نمونه بر روی لام نئوبار منتقل کرده و سپس سلول‏های پنج مربع مشبک شمارش می‏گردد. درصد سلول‏هایی که با تریپان بلو رنگ‏آمیزی نشده‏اند بیانگر تعداد سلول‏های زنده است. غلظت سلولی Cells/ms برابر است با: (تعداد سلول شمارش شده Х10⁴ تقسیم بر 5) و میزان درصد سلولهای زنده از طریق فرمول (تعداد سلول‏های زنده Х 100 تقسیم بر تعداد کل سلول‏ها) محاسبه می‏گردد (Butler, 2004; Patterson, 1979) سپس 70 میکرولیتر از این سوسپانسیون را برداشته و در چاهک‏های پلیت 96 خانه‏ای وارد کرده و به همه چاهک‏ها 10 میکرولیتر از غلظت‏های مختلف روی (غلظت صفر به عنوان شاهد تا غلظت 200 میکرومولار) اضافه گردید سپس به همه چاهک‏ها 20 میکرولیتر محیط کشت RPMI-1640 به همراه 10% سرم گاوی (تهیه شده از شرکت سیگما آمریکا) که محیط کشت اختصاصی برای سلول‏های رده لنفوئیدی B و T می‏باشد اضافه گردید (Butler, 2004). محتویات چاهک‏ها جهت بررسی سلول‏های زنده زیر میکروسکوپ معکوس (اینورت) مشاهده شدند. سپس پلیت‏ها را در انکوباتور CO₂دار در دمای ^C°37 قرار داده و پس از پایان یافتن انکوباسیون در فواصل زمانی 12، 24، 36، 48،60 و 72 ساعت، 5 چاهک پلیت برای هر گروه از غلظت‏های کلرید روی جهت شمارش و بررسی تعداد سلولهای زنده مورد بررسی قرار گرفتند. این آزمایش برای هر سلول رده لنفوئیدی B و T در غلظت‏های مختلف کلرید روی 3 دفعه تکرار شد. برای تعیین سلول‏های زنده در هر بار شمارش به اندازه حجم سوسپانسیون سلولی همان حجم تریپان بلو (W/V %2/0 تریپان بلو در بافر فسفات سالین PBS) استفاده شد. سپس بعد از 2 دقیقه نمونه‏ها را بوسیله تکنیک هموسایتومتر (لام نئوبار) شمارش کرده و سلول‏های رنگ‏آمیزی نشده بیانگر تعداد سلول‏های زنده بود، با استفاده از فرمول (تعداد سلول‏های زنده Х 100 تقسیم بر تعداد کل سلول‏ها)، درصد سلول‏های زنده محاسبه شد شمارش هر سلول در هر غلظت کلرید روی به منظور کاهش خطا 3 مرتبه انجام شد. داده‏های جمع‏آوری شده با استفاده از نرم‏افزار SPSS و آزمون‏های آماری از جمله آزمون T-test و آزمون Kruskal-Wallis test تجزیه و تحلیل شدند و تعداد درصد سلول‏های زنده در هر گروه زمانی و هر غلظتی با گروه شاهد همان ساعت مورد مقایسه قرار گرفت. همچنین درصد تعداد سلول‏های زنده در دو گروه با اثر غلظت کلرید روی کمتر از 50 میکرومولار با غلظت کلرید روی 50 و بیشتر از 50 میکرومولار در هر ساعت پس از انکوباسیون مورد مقایسه قرار گرفت. همچنین داده‏های بدست آمده در سه مرتبه تکرار نسبت به هم مقایسه شدند و میانگین درصد تعداد سلول‏های زنده راجی نسبت به میانگین درصد تعداد سلول‏های زنده مولت -4 مقایسه شدند و 05/0 P< به عنوان سطح معنی‏داری در نظر گرفته می‏شود.

نتایج

داده‏های بدست آمده در سه بار تکرار آزمایش نسبت به هم مقایسه و هیچکدام تفاوت معنی‏داری نداشتند. همچنین نتایج نشان می‏دهد غلظت‏های 1، 5، 10، 20، 30 و 40 میکرومولار کلرید روی بر سلول‏های رده لنفوئیدی B و T (راجی و مولت -4) پس از 12، 24، 36، 48، 60 و 72 ساعت انکوباسیون مشخص می‏شود درصد تعداد سلول‏های زنده تفاوت معنی‏داری با گروه شاهد نداشت (05/0P>). در غلظت‏های 50، 75، 100، 125، 150، 175 و200 میکرومولار پس از 12، 24، 36، 48، 60 و 72 ساعت انکوباسیون درصد تعداد سلول‏های زنده راجی و مولت -4 نسبت به گروه شاهد کاهش معنی‏داری را نشان داد (05/0P<). همچنین میانگین درصد تعداد سلول‏های زنده رده لنفوئیدی B (راجی) نسبت به سلول‏های رده لنفوئیدی T (مولت-4) اختلاف معنی‏داری نداشتند (05/0> P) (شکلهای 1 الی 12).

در بررسی میانگین درصد تعداد سلول‏های زنده در دو گروه با اثر غلظت کلرید روی کمتر از 50 میکرومولار با غلظت کلرید روی 50 و بیشتر از 50 میکرومولار در هر ساعت پس از انکوباسیون و هر دو نوع سلول مورد بررسی، اختلاف معنی‏داری مشاهده می‏شود بطوری که تعداد سلول‏های زنده در گروه با غلظت 50 میکرومولار و بیشتر از 50 میکرومولار نسبت به گروه با غلظت پائین‏تر از 50 میکرومولار کاهش معنی‏داری دارد (05/0 < P ) (شکل 13 و 14).

بحث

یافته‏های این مطالعه با نتایج Wellinghausen et al. (2000) تفاوت معنی‏داری را نشان نداد. به طوری که در هر دو مطالعه در حضور غلظت‏های بالای کلرید روی عملکرد سلول‏های مولت-4 تضعیف می‏شود (Wellinghausen, 2000). همچنین مطالعات Michiko et al. (2000) بر روی سلول‏های مولت-4 موید این نکته است که با افزایش میزان غلظت کلرید روی میزان تحمل سلول‏های رده

شکل 1. مقایسه اثر غلظتهای مختلف کلرید روی بر روی میانگین درصد تعداد سلول‏های زنده

رده لنفوئیدی B (راجی) پس از 12 ساعت انکوباسیون