مجله علمی – پژوهشی زیست شناسی جانوری تجربی

سال اول، شماره اول، تابستان 1391 (80 - 69)

وضعیت فعالیت آنتی اکسیدانی و نارسایی قلبی در جوجه های مبتلا به سندرم افزایش فشار خون ریوی

مختار فتحی^1*، تیمور تنها²

1. استادیار دانشگاه آزاد شبستر 2. استادیار دانشگاه پیام نور

 (تاریخ دریافت:28/12/1390 ، تاریخ تصویب: 21/4/1391)

چکیده

   160جوجه نر سویه راس برای بررسی وضعیت آنتی اکسیدانی به مدت 6 هفته مورد بررسی قرار گرفتند. جوجه ها به طور کاملاً تصادفی در دو تیمار با 4 تکرار و 20 جوجه برای هر تکرار تقسیم شدند. گروه اول در دمای پرورشی استاندارد پرورش یافتند (تیمار¹NT) ولی گروه دوم برای القای سندرم افزایش فشار خون ریوی (آسیت) و ایجاد نارسایی قلبی عروقی، در دمای سرد طبق برنامه دمایی ویژه ای قرار گرفتند (²CT). پارامترهای فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی گلوتاتیون پراکسیداز (³GPX) پلاسما و کبد، سوپراکسیددیسموتاز (⁴SOD) پلاسما و کبد، وضعیت کل آنتی اکسیدانی پلاسما (⁵TAS) ، غلظت مالون دی آلدئید)⁶(MDA پلاسما و کبد و نمونه گیری از بافت کبد در روزهای 21 و 42 انجام شد. در روز آخر آزمایش(روز42) 2 جوجه از هر تکرار به طور تصادفی انتخاب و بعد از توزین کشتار شدند. قلب برداشته و بعد از بررسی ناحیه پری کاردیوم آن، وزن قسمتهای آن جدا و شاخص آسیتی وزن بطن راست به کل بطن(⁷RV/TV) محاسبه شد. نتایج نشان داد میزان MDA در پلاسما و بافت کبد در روزهای 21 و 42 درپرندگان  تیمار CT بیشتر از تیمار NT بود(P<0.05). فعالیت آنزیم GPX پلاسما و بافت کبد در روزهای 21 و 42 و SOD پلاسما در روز 42 درپرندگان تیمار CT کمتراز تیمار NT بود. (P<0.05) میزان پلاسمایی TAS نیز در پرندگان تیمار NT روزهای 21 و 42 بیشتر از تیمار CT بود(P<0.05). نسبت RV/TV در روز 42 و تلفات در کل دوره نیز در تیمار CT بیشتر از تیمار NT بود. (P<0.05)

واژه های کلیدی: آسیت،آنتی اکسیدان ، هیپرتروفی، بطن راست، مالون دی آلدئید ،تلفات.

* نویسنده مسئول: مختار فتحی                                                                                                                                     fathi_mokhtar@yahoo.com

¹ Natural Temperature (NT)  ² Cold Temperature (CT)  ³ Glutathione Peroxidase ( GPX)  ⁴ superOxide Dismutase(SOD)⁵ Total Antioxidant Status (TAS)    ⁶ Malondialdehyde (MDA)    ⁷ Right Ventricle /Total Ventricle (RV/TV)

مقدمه

   هنگام افت اکسیژن محیط، وقتی سیستم مبادله گازی سخت و تا سرحد محدودیت فیزیولوژیکی خود درگیر تبادل اکسیژن هستند، این افزایش متابولیک سلولی می تواند منجر به هیپوکسی سلولی نیز شود(Scheele et al, 1991). و بدن برای جلوگیری از هیپوکسی سلولی، قلب مجبور به افزایش خروجی قلب و افزایش جریان خون می شود و نتیجه بعدی آن افزایش فشار خون ریوی خواهد بود (wideman et al, 1988). بنابراین پیشنهاد شده است که سندرم آسیت اساساً به وسیله هیپوکسیمیا و به دنبال سلسله ای از عوامل شامل افزایش خروجی قلب، افزایش فشار خون ریوی، افزایش فشار خون بطن راست،  هیپرتروفی بطن راست، نقص دریچه راست قلب، گرفتگی سیاهرگ مرکزی، خارج شدن مایعات عمدتاً به حفره شکمی و ناحیه پری کاردیوم قلب و در نهایت مرگ در اثر ناتوانی قلب رخ می دهد (Daneshyar et al,2009).

پیشنهاد کرده اند که احتمالاً تنش اکسیداتیو نیز در پاتولوژی درگیر با بروز سندرم افزایش فشار خون ریوی و نارساییهای قلبی عروقی مرتبط این سندرم نقش داشته باشد (Maxwell, 1990 , ؛ Bottje, 1995؛ Igbal et al, 2002). تنش اکسیداتیو زمانی رخ می دهد که وجود اکسیدانها در سلول ها بیش از توان آنتی اکسیدانی آنها باشد (Igbal et al, 2002). رادیکال های آزاد مشتق شده از اکسیژن، می توانند نقش بسیار مهمی در بروز آسیب های بافتی داشته باشند به طوری که آنیونهای سوپراکسید می توانند سبب کاهش عمرقابل دسترسی نیتریک اکسید (NO) شوند یعنی از طریق نیمه عمر برای این گشاد کننده عروق، سبب کاهش در دسترسی بودن آن شده و لذا کاهش توان انبساط پذیری عروق می شوند (Lorenzoni et al, 2006). علاوه بر این، گزارش کرده اند که احتمالاً این رادیکال های آزاد سوپراکسید، می توانند با NO واکنش داده و تولید رادیکال سمی جدیدی به نام پیروکسی نیتریت نمایند که این رادیکال جدید، که بسیار توان نفوذ پذیری به داخل سلول را دارد، توانایی اکسیداسیون محتویات سلولی از قبیل لیپیدها، پروتئین ها و حتی DNA را دارد و سبب آسیب جدی به بافت ها می شود.( Ruiz-Feria, 2009). لذا توان آنتی اکسیدانی سلول ها و بخصوص در بافت های درگیر از قبیل شش، قلب و کبد داشته و نقش بسیار مهمی در بروز آسیب های ناشی از مشکلات تنش اکسیداتیو خواهد داشت. با توجه به اینکه افزایش فشار خون در بطن راست یکی از مشخصه های بروز آسیت است، لذا پیشنهاد کرده اند که شاخص نسبت وزن بطن راست به وزن کل بطن ها (RV/TV)، می تواند تعیین کننده بروز و شدت این سندرم باشد به طوریکه شاخصهای RV/TV را که بالاتر از 27/0 باشد به عنوان بروز آسیت تلقی می شود(Huchzermeyer, 1986). اما لازم به ذکر است که تغییرات پارامترهای خونی و فاکتورهای آنزیمی پلاسما و بافتهای درگیر مثل کبد، می تواند بسیار زودتر و سریع تر از شاخص RV/TV بروز نماید (Lorenzoni et al, 2006)، لذا هدف اصلی این آزمایش بررسی وضعیت پارامترهای آنتی اکسیدانی پلاسما در جوجه ها ی گوشتی درگیربا آسیت القایی به روش سرما بوده است.

مواد و روش ها

160 جوجه نر گوشتی 14 روزه از سویه راس 308 در این آزمایش استفاده شدند. نصف این جوجه ها، در 4 قفس سیمی( 1×2 متر مربع) که هر یک حاوی 20 جوجه بودند قرار گرفتند و در برنامه دمایی استاندارد ، به طوریکه تا هفته چهارم در شرایط منظم دمایی بودند و سپس تا هفته ششم در دمای ثابت 1 ±22 تا آخر آزمایش پرورش داده شدند (تیمارNT). اما گروه دوم برای القاء آسیت در سالنی دیگر و در دمای سرد پرورش داده شدند به طوریکه در هفته اول و دوم دما به ترتیب 32 و 30 درجه سانتیگراد بود اما روز 15م،  دما به 25 درجه کاهش یافت روزانه 5/1-1 درجه دما کاهش یافت به طوریکه در روز 21 م دما به زیر15 درجه رسید و تا پایان آزمایش دما بین 15-10 درجه سانتیگراد باقی ماند(تیمارCT) (Fathi et al, 2011 , 2012 ).پرندگان در طول آزمایش، دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند. همه جوجه ها با یک جیره آردی بر پایه ذرت- سویا آغازین( حاوی 3200 کیلوکالری انرژی و 04/22 درصد پروتئین خام ) تا سن 21 روزگی و بعد از آن از یک جیره رشد( حاوی 3200 کیلوکالری انرژی و 26/20 درصد پروتئین خام) تغذیه شدند. روز 21  و 42، پس از 3 ساعت گرسنگی دو جوجه از هر قفس به طور تصادفی انتخاب و از هرکدام دو نمونه خونی از سیاهرگ زیر بال گرفته شد یکی از نمونه ها در سرنگ های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA پتاسیم دار، وارد شدند و برای اندازه گیری GPX در خون تام استفاده شد نمونه دیگر بلافاصله سانتریفوژ شده و پلاسمای به دست آمده،در دمای 80- تا زمان آزمایشات آنزیمی نگهداری شدند. سپس نمونه های پلاسما در دمای معمولی آزمایشگاه ذوب شده و برای اندازه گیری های پارامترهای وضعیت آنتی اکسیدانی از قبیل MDA, GPX, SOD, TAS استفاده شدند. هم چنین  بعد از خون گیری از جوجه ها، آنها کشتار شده وبعد از  بررسی مشاهدات آسیت، از کبد آن نمونه برداری شد نمونه های کبد بعد از شتشو با آب مقطر، بلافاصله با پارچه تمیز تیترون خشک شده و در پلاستیک های فریزر و تمیز در دمای 80- فریز شدند و بعداً برای پارامترهای وضعیت آنتی اکسیدانی از قبیل MDA, GPX, SOD,  استفاده شدند. مقادیر GPX , SOD, TAS هم با استفاده از کیت های شرکت راندوکس کشور انگلیس و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده آن بدون تغییر اندازه گیری شدند.  بعد از نمونه برداری از کبد، قلب جوجه های کشتار بعد از مشاهده وضعیت ناحیه پرکاردیوم، برداشته شد و بطن ها از دهلیز به صورت دقیق جدا گشت و بعداً هم بطن راست از بطن چپ از ناحیه سپتوم جدا شده و بعد از توزین جداگانه بطن ها، نسبت RV/TV هم برای همه جوجه های کشتار شده در روز 42 محاسبه شد. و نسبتهای بالاتر از 27/0 به عنوان آسیت ثبت می شد. لازم به ذکر است که تلفات نیز به صورت روزانه ثبت شد و تلفات برای بررسی دلیل مرگ و نارساییهای قلبی کالبد گشایی شد به طوریکه علایم آسیت بسته به مشاهده می تواند یکی از موارد زیر باشد:

1- هیپرتروفی بطن راست ، سستی ماهیچه قلب  2- کبد ورم کرده و شق و سفت شده  3- مایع زرد رنگ، کلوییدی و روشن در محوطه شکمی(Ging et al, 2004). داده های مربوطه در قالب یک طرح کاملاً تصادفی با 2 تیمار و 4 تکرار و با استفاده از روشGLM  نرم افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت ( SAS 9.1) مقایسه اختلاف معنی دار بین میانگین تیمارها در سطح احتمال 95 درصد (P<0.05) با استفاده از آزمون توکی صورت گرفت.

نتایج

فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی، TAS و سطوح MDA در پلاسما:

   داده های جدول 1، نشان می دهد که در روز 21، اختلاف معنی داری(P<0.05) در دو شاخص MDA  و TAS بین دو تیمار NT و CT وجود داشت بطوریکه پرندگان تیمار CT دارای MDA بیشتر و TAS کمتری نسبت به تیمار NT بود. اما در روز 42،  بین دو تیمار CT و NT اختلاف معنی داری در همه شاخصهای MDA، SOD، GPX و TAS پلاسما وجود داشت به طوریکه پرندگان تیمار CT به طوری معنی دار دارای  مقادیر بالاتر، MDA، و کمتر SOD، GPX و TAS در مقایسه با گروه NT بود.

 فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی و سطوح MDA در کبد: همانطور که درجدول 2 نشان داده شده است، در روز 21، پرندگان تیمار CT  درمقایسه با تیمار  NT  دارای MDA بیشتری(P<0.05) در بافت کبد بود.

هم چنین در روز 42، پرندگان تیمار CT به طور معنی داری (P<0.05) دارای مقادیر  کمتر SOD ، GPX و بیشتر MDA در بافت کبد بود.

 نسبت RV/TV و مرگ و میر ناشی از آسیت:

داده های موجود در جدول 3، نشان می دهد که پرندگان تیمار CT دارای نسبت RV/TV و مرگ و میر ناشی از آسیت بیشتری (P<0.05) در مقایسه با تیمار NT بود.

[1] Right Ventricle/ Total Ventricle (RV/TVبطن راست به کل بطن))

بحث

   در آزمایش ما نسبت بطن راست به کل بطن 31/0 در جوجه های تیمار CT در مقایسه با مقدار 23/0 برای جوجه های تیمار NT به دست آمد(جدول 3) بطوریکه این تفاوت معنی دار بود (P<0.05) و این نشان از آن است که استرس سرمایی به طور قابل قبولی سبب القاء موفقیت آمیز سندرم آسیت و افزایش فشار خون ریوی شده است.

   نشان داده اند که تغییرات هماتولوژی، و به دنبال آن تغییر در وزن بطن راست و به طور دقیق تر نسبت وزن بطن راست به کل بطن می تواند شاخص خوبی برای تشخیص بروز سندرم افزایش فشار خون ریوی باشد ( Lorenzoni et al, 2006)،  به طوریکه نسبت بطن راست به کل بطن بالاتر از 27/0 به عنوان شاخص دقیق بروز سندرم افزایش فشار خون ریوی و آسیت در نظر گرفته می شود (Daneshyar et al, 2009).

یکی از فاکتورهای مرتبط قابل بحث با پاتولوژی و بروز سندرم افزایش فشار خون ریوی و نارسایی قلب در جوجه های درگیر با آسیت، تنش اکسیداتیو است به طوریکه مشاهده نموده اند پرندگان درگیر با آسیت، دارای مقادیر گلوتاتیون اکسید شده (GSSH) بالا و یا نسبت های بالای گلوتاتیون اکسید شده به احیاء شده (GSSG/GSH) بودند  و هم زمان افزایشی در پروکسیدهای لیپید در پلاسما، کاهش عمده ای در آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی مثل آلفا توکوفرول و ویتامین C در بافتهای کبد و شش پرندگا ن مبتلا به آسیت وجود داشت ( Bottje and widman, 1995, 1997).

داده های موجود در جدول های 1 و 2 نشان می دهد که این شاخصهای بررسی وضعیت آنتی اکسیدانی در پلاسما و کبد، به طور معنی داری تحت تاثیر استرس سرمایی قرار گرفته است، به طوریکه تیمار CT در مقایسه با تیمار NT، به طور معنی داری(P<0.05) دارای فعالیت کمتر آنزیم های آنتی اکسیدان GPX، SOD و مقادیرMDA  بیشتر  در پلاسما و کبد، بود و هم زمان تیمارCT، دارای سطوح ظرفیت آنتی اکسیدانی پلاسما (TAS) پایین تری در مقایسه با تیمارNT بود.

   گزارش نمودند که در موش های تحت تنش اکسیداتیو القایی، افزایش سطح MDA و کاهش هم زمان غلظت آنزیم های GPX و SOD در بافت قلب (Subranaim, 2007؛ Anbin izhilan, 2008)، بافت کبد (YU, J. C, 1999) و بافت روده (Mustafa, K, 2009 Mustafa, K) رخ داد.

   کاهش ظرفیت آنتی اکسیدانی خون، کاهش غلظت آنزیم های آنتی اکسیدانی (GPX) و (SOD)، و افزایش MDA، در تیمار دمای سرد،  می تواند نشانگر خوبی از افزایش رادیکال های آزاد در اثر القا سرمایی آسیت در این آزمایش باشد. اندازه گیری سطح MDA، می تواند شاخص خوبی برای اندازه گیری شدت تنش اکسیداتیو در بافت های درگیر باشد، به طوری که رادیکال های آزاد ROS می توانند با اکسیداسیون ترکیبات داخل سلولی (پروتئین ها، لیپیدها و DNA) و هم چنین پروکسیداسیون لیپیدهای غشایی سبب تولید مقادیر بالایی از MDA گردد. هم چنان که در این آزمایش هم مشخص شد، مقادیر بیشتر MDA پلاسما و کبد پرندگان آسیتی وجود دارد Nain et al, 2008)). همچنین پیشنهاد کردند، پروکسیداسیون لیپیدها، می تواند تغییرات عمده ای در ساختار غشاهای سلولی و اندامک های داخل سلولی ایجاد کند به طوری که سبب آسیب های جدی به اندامک هایی مثل شبکه رتیکولوم سارکوپلاسمیک و میتوکندری به خصوص در بافت قلب شود. به طوری که پرندگان مبتلا به نارساییهای قلبی(CHF[1]) ناشی از تنش اکسیداتیو، دارای مقادیر بالایی از کلسیم در سیتوپلاسم سلول های میوکاردیوم قلب خود بودند (Li et al,2006). هم چنین  Olkowski,2007))، گزارش کردند، متابولیسم انرژی در بافت قلب پرندگان درگیر با تنش اکسیداتیو به شدت با مشکل مواجه خواهد شد و تغییرات ساختاری و بیوشیمیایی ویژه ای در بافت قلب این پرندگان رخ خواهد داد و مقادیر بالایی از MDA در میوکاردیوم قلب پرندگان درگیر با آسیت وجود داشته و این نشان از رخداد تنش اکسیداتیو شدیدی در بافت قلب دارد

   اندازه گیری سطوح مالون دی آلدئید(MDA)، می تواند شاخص خوبی برای اندازه گیری شدت تنش اکسیداتیو در بافت های درگیر باشد به طوریکه رادیکال های آزاد ROS، می توانند با اکسیداسیون ترکیبات داخل سلولی(پروتئین ها، لیپیدها و DNA)  و هم چنین پروکسیداسیون لیپیدهای غشایی، سبب تولید مقادیر بالایی از MDA، گردد (Nain et al,2008). همچنانکه در این آزمایش هم مشخص شد در پلاسما و بافت کبد مقادیر بالاتر و معنی داری از MDA در پرندگان آسیتی در مقایسه با پرندگان سالم، مشاهد شد. پیشنهاد کردند (Nain et al,2008) که پروکسیداسیون لیپیدها، می تواند موجب تغییرات عمده ای در ساختار غشاهای سلولی و اندامک ها داخل سلولی گردد به طوریکه سبب آسیب های جدی به اندامک هایی مثل شبکه رتیکولوم سارکوپلاسمیک و میتوکندری، بخصوص در بافت قلب گردد. به طوریکه گزارش کرده اند در پرندگان مبتلا به نارساییهای قلبی(CHF)، مقادیر بالایی کلسیم در سیتوپلاسم سلول های میوکاردیوم قلب آنها وجود داشت ( Li et al 2006).

نتیجه گیری

   سندرم افزایش فشار خون (آسیت) القایی به روش سرما، می تواند سبب القاء تنش اکسیداتیو شود به طوریکه باعث کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی از قبیل GPX و SOD، افزایش سطوح MDA  و کاهش ظرفیت آنتی اکسیدانی TASدر پلاسما، کبد و سایر بافت های درگیر شود.

سپاسگزاری

   بدین وسیله از کلیه پرسنل و مسئولین و مدیریت کشت و صنعت اشراق وابسته به بنیاد شهید انقلاب اسلامی که در اجرای این پ‍ژوهش ما را یاری نمودند و بویژه جناب آقای مهندس کریمی و جناب آقای صادق الحسینی، تشکر و قدردانی می گردد.